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液相色譜法分析啤酒花浸膏中的 6 種酸性成分
更新時間:2019-07-30   點擊次數:1648次

本文采用HPLC分析啤酒花浸膏中的葎草酮、合葎草酮加葎草酮蛇麻酮合蛇麻酮和加蛇麻酮6種同系化合物,通過優化色譜條件,在等度洗脫條件下實現了其中兩對難分離同分異構體的基線分離;收集這6種組分并對其進行了紫外(UV)光譜、紅外(IR)光譜和質譜(MS)表征。

1實驗部分

11儀器和藥品

P230II高壓恒流泵,UV230II紫外-可見波長檢測器,ZW色譜柱恒溫箱;7725i手動進樣閥(美國Rheodyne ) ;Finnigan   -    ( Thermo公司) ;TU-1810APC紫外-可見分光光度計;EQUINOX55型傅里葉變換紅外光譜儀(德國BRUKER公司)

甲醇乙腈、乙醇(色譜純) ;磷酸(分析純) ;實驗用水由Milli-Q純水系統(美國Millipore公司)制備;啤酒花浸膏。

12樣品制備

稱取1.0056g浸膏于5mL離心管中,在30°C水浴中超聲振蕩,用30mL甲醇分多次將樣品轉移至50mL燒杯中,在水浴中超聲振蕩30min后轉移至100mL   中,用    容,充   。19.0mL上述溶液于50mL容量瓶中,用甲醇定容,混勻,用0.45μm油膜過濾,濾液供分析。樣品應在避光、低溫條件下保存。

13分析條件

HPLC條件:HypersilODS2色譜柱(250mm×4.6mm,5μm) ,流動相為乙腈-0.1%(v/v)磷酸水溶液(pH2.2) (6535,v/v) ,流速為1.0mL/min,檢測波長為315nm,進樣量為20μL,柱溫為室溫。

UV光譜條件:樣品用乙腈溶解,掃描波長范圍為199499nmIR光譜條件:將樣品與干燥的KBr粉末按1100的質量比混合,在瑪瑙研缽中研磨壓片,掃描范圍為4500500cm1

MS條件:電離方式為電噴霧電離(ESI) ,離子源溫度為150.00°C,檢測器電壓為3.05kV,質量掃描范圍為m/z300.001000.00,一級全掃描質譜分析。

2結果與討論

21色譜條件的優化

211磷酸的影響

以甲醇-(0.26%磷酸或磷酸調節pH2.5)為流動相分析啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸為參考,考察了酸的加入對HPLC分離啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸的影響從圖2a中可以看出,不加酸時色譜峰展寬,且嚴重拖尾,分離度低;加入0.1%(v/v)磷酸后目標物的出峰時間比不加酸時滯后了34min(見圖2b) ,其原因可能是不加酸時啤酒花浸膏樣品中的有效成分解離,以離子形式存在,在C18柱中保留相對較弱,導致出峰提前;加入酸使流動相的酸度增加,抑制了目標物在溶劑中的解離,使目標物峰的峰形得到改善,柱效增加,樣品的分離度也明顯提高

212有機溶劑的影響

考察了分別以甲醇乙醇及乙腈作為流動相中的有機相對啤酒花浸膏的HPLC分離效果。從圖3a可知,以甲醇作有機相時zui大保留時間大于350min,且組分23沒有達到基線分離;從圖3b可知,以乙醇作有機相時可分出4種組分,分別為合葎草酮(1)、葎草酮與加葎草酮合峰(2+3)合蛇麻酮(4)、蛇麻酮與加蛇麻酮合峰(5+6) ,兩對同分異構體都沒有得到很好的分離;從圖3c可知,乙腈的選擇性相對較好,用其作有機相時柱壓較小,且6種組分均得到了較好的分離,兩對同分異構體的分離度(Rs)分別為1.581.55,均實現了基線分離,故選擇乙腈作流動相的有機相。

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213溫度的影響

在色譜分離中,色譜柱溫度的改變會影響樣品的分離度及保留時間,故有考察的必要。研究結果表明,溫度每上升5°C,分離時間縮短約5min(以組分5,兩對同分異構體的分離度變化如表1所示。

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柱溫從室溫(25°C)上升到35°C時,組分2356的分離度分別下降12.7%18.7%,分離度均低于1.5,不能達到基線分離的要求12;溫度上升到45°C時,組分56的分離度下降了約30%。溫度的升高雖然使保留時間提前,但分離度相應地降低,使兩對同分異構體的分離效果變差,不能達到基線分離,故選擇柱溫為室溫。

22有效成分的制備與表征

221有效成分的制備

1.2節中所制備的樣品在*分離條件下進樣,按出峰時間收集6種組分(合葎草酮葎草酮加葎草酮、合蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮,分別記為III、IIIIV、VVI。1.3節所述的分析條件分別對收集的6個組分進行HPLC分析,檢測其純度通過面積歸一化法測得6種組分的純度分別為98.2%、94.3%、96.6%93.2%92.6%90.2%。

222結構表征

(1)UV光譜:組分IUV光譜如圖4所示,其zui大紫外吸收波長max)227nm;從其余5種組分的UV光譜(圖略)可見其λmax分別為222、222323、321323nm。320nm左右有強的UV吸收帶說明結構式中有3個共軛雙鍵,且此處的吸收譜帶說明還有外環羥基的作用。羥基是助色基團,其與苯環連接,形成n-π共軛導致其zui大吸收波張紅移至220nm左右有zui大吸收波長;大于270nm處的譜帶是由于結構式中的羰基的紫外吸收所致;222nm、227nm處的吸收主要是由于六元環上的烯醇式-酮式互變作用引起。

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(2)IR光譜:組分IIR光譜見圖5(其余5種組分的IR光譜圖略)該化合物在3412cm1的吸收譜帶是羥基的伸縮振動吸收峰;29752840cm13個強吸收譜帶,說明分子內有甲基、次甲基、   CH對稱與不對稱伸展振動;1467cm1的譜帶說明分子中含有甲基或乙基;1378cm1處的吸收譜帶證實有甲基存在;15251680cm1處的一組譜帶是六元環共軛體系C=C和鄰 C=O       ;12001000cm1處的吸收帶表示六元環上的碳氫面內的彎曲振動,說明環上有鄰、、對位取代基該表征結果與其結構吻合。

(3)LC-MS:組分I的質譜圖見圖6,可以看出其準分子離子峰為m/z348.96;其余5種組分的準分子      m/z362.92、362.96400.94、414.94414.966種組分的分子式分別為C20H28O5、C21H30O5、C21H30O5、C25H36O4、C26H38O4、C26H38O4MS表征結果與理論值一致。

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通過UV光譜、IR光譜和MS對收集的6種組分進行表征,結果與其結構吻合,確認所收集的組分I為合葎草酮,II為葎草酮,III為加葎草酮,IV為合蛇麻酮,V為蛇麻酮,VI為加蛇麻酮。

3結語

建立了HPLC同時測定啤酒花浸膏中6種活性組分的方法,在等度洗脫下實現了兩對難分離同分異構體的基線分離該法具有簡便穩定分離度好等優點,可用于啤酒花浸膏中酸性成分的分析。

 

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