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液相色譜儀HPLC測定石杉堿甲的含量
更新時間:2017-10-10   點擊次數:1562次

液相色譜儀HPLC測定石杉堿甲的含量

石杉堿甲是石杉科植物中提取的一種生物堿,是一強效的膽堿酯酶可逆性抑制劑,其作用特點與新斯的明相似,但作用維持時間比后者為長。對真性膽堿酯酶具有選擇性的抑制,抑制強度是假性膽堿酯酶的數千倍;抑制方式為競爭性和非競爭性的混合型抑制,與單純競爭性抑制劑有顯著不同;易通過血腦屏障進入中樞,兼具有中樞及外周治療作用;有效時間長;從胃腸道吸收良好;安全指數大;穩定性好。

由于蕨類植物生長緩慢,繁殖困難,造成了石杉堿甲的原料藥價格昂貴,因此,建立一個石杉堿甲含量的快速檢測方法很有必要。為了科學、合理地利用石杉屬植物資源,采用HPLC法對石杉中石杉堿甲的含量進行測定,為尋找和篩選石杉堿甲新的植物資源提供科學依據。

1、儀器與試藥

 

安捷倫液相色譜儀HPLC((帶四元泵,自動進樣器,紫外檢測器等);梅特勒天平;KQ50B超聲清洗器;電熱恒溫水浴鍋;石杉堿甲對照品(100243-200401);乙腈(色譜純);二次重蒸水;其他試劑均為分析純。

 實驗藥材采至貴州黔東南,由貴州科學院生物研究所王培善教授鑒定為昆明石杉,標本存放于貴陽中醫學院民族醫藥研究所,標本憑證(20056)。

昆明石杉

2、液相色譜儀HPLC測定石杉堿甲的含量方法與結果

2.1色譜條件

ZORBAXSB-C18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm),流動相0.02mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈 (92∶8),檢測波長為310nm,流速1ml·min-1,柱溫25℃,進樣量為5μl。在此色譜條件下,樣品中的石杉堿甲與其他峰能達到基線分離, 其理論塔板數為4656,對稱因子為0.92。石杉堿甲的保留時間為11.15min。

 

2.2樣品的制備

 

精密稱取實驗藥材細粉2g于500ml的圓底燒瓶中,每次加入200ml石油醚提取3次,棄去濾液。濾渣再用95%的甲醇提取3次,合并濾液并 回收溶劑,加入2%的酒石酸溶解,用氨水調節pH值至8.0,再用氯方萃取至Dragendorffors反應呈陰性,揮干有機溶劑,用無水乙醇溶解并定 容至25ml即得。

 

2.3線性關系的考察

 

精密稱取石杉堿甲對照品2.40mg于25ml容量瓶中以無水乙醇溶解并定容,得濃度為0.096mg·ml-1對照品溶液,再分別稀釋成 0.096,0.048,0.024,0.012,0.006,0.003mg·ml-1的對照品供試液,在色譜條件下測定。以進樣濃度對峰面積進行回 歸,得方程:Y=6776.0151X1.0305,r=0.99995。可知石杉堿甲在0.015~0.48μg之間與峰面積呈良好線性關系。

 

2.4精密度實驗

取石杉堿甲對照溶液,在色譜條件下重復進樣6次,結果石杉堿甲峰面積的RSD為0.36%(n=6)。

 

2.5穩定性實驗

取供試品溶液,每隔2h測定1次,考察石杉堿甲的含量變化,結果含量的RSD為0.85%(n=6),表明供試品在10h內穩定。

 

2.6重復性實驗

精密稱樣品6份,按“2.2”項的要求制備6份供試液,在色譜條件下分別進行測定,結果Hup-A含量的RSD為0.60%(n=6)。

 

2.7回收率實驗

精密稱取昆明石杉藥材細粉6份,每份1g,分別加入對照品供試液(0.003mg·ml-1)100ml,按樣品制備方法和色 譜條件,制備加樣回收供試液進行測定,計算回收率(見表1)。結果石杉堿甲的平均回收率為99.63%,RSD=0.56%(n=6)。表1石杉堿甲加樣 回收率實驗結果(略)

 

2.8樣品的測定

 

按“2.2”項的要求精密稱取樣品3份,制備供試液,按色譜條件進行測定,重復3次,取平均值,石杉堿甲在原植物中的平均含量為0.03%。

 

3、液相色譜儀HPLC測定石杉堿甲含量的結論

我們建立了用HPLC反相柱從石杉總堿中直接測定石杉堿甲的方法,該方法線性與精密度良好,平均回收率為99.89%,平均RSD為0.40%。實驗證明該方法易行、靈敏、準確、可靠。在生產石杉堿甲的工作中得到了證實。  

 

測定方法是在其它石杉中石杉堿甲含量測定方法的基礎上,改用ZORBAXSB-C18色譜柱及以0.02mol·L-1磷酸二氫鉀-乙腈(92∶8)為流動相。

從石杉堿甲原植物中提取總生物堿,是一個常規和穩定的方法。通過測定總堿中石杉堿甲的含量,便可以推算出原植物中石杉堿甲的含量。該方法已經成為檢定原植物的方法并應用于工作中。

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